Худей и больше не толстей

Диагностика методом пцр: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

Что это такое?

ПЦР относится к молекулярно-генетическим тестам. Его работа основана на определении фрагментов ДНК и РНК возбудителей инфекции по определенной последовательности нуклеотидов в цепочке. Суть метода состоит в активизации репликации генетического материала бактерии или вируса. Чтобы запустить реакцию, достаточно единичных фрагментов ДНК или РНК патогена.

Анализ проводится в лабораторных условиях. С помощью специальных ферментных систем, специфических для искомой инфекции, ускоряется деление генетического материала патогена — каждый раз удваивается. Цепная реакция включает множество циклов. При каждом из них количество фрагментов нуклеотидных цепочек увеличивается в геометрической прогрессии. По окончании теста маркеров возбудителя становится настолько много, что определить их не составляет сложности.

Получается, если изначально в материале был фрагмент генетического материала вируса или бактерии, который было невозможно обнаружить, после ПЦР количество увеличивается в десятки раз и выявить его просто.

Метод ПЦР считается ультрачувствительным. Он отражает наличие инфекции в организме, даже если заражение состоялось недавно, иммунитет не успел на него отреагировать, а численность инфекционных агентов минимальна.

Бактерии или вирусы вносят изменения в ДНК человека, другими словами, «оставляют отпечатки». Реактивы, используемые при ПЦР, отыскивают их и заставляют многократно делиться. Поэтому установить инфицирование можно всегда, даже если заболевание развивается бессимптомно или возбудитель персистирует в латентном режиме.

ПЦР считается очень специфичным анализом. Ферментные системы нацелены на конкретный антиген и активны только против него. Достоверность метода достигает 100%. Если внутри организма нет малейших признаков искомой инфекции, то бишь, конкретной последовательности нуклеотидов (уникальна для каждого живого существа), исследование не даст положительный результат. Исключения есть, но они сведены к минимуму, поэтому ПЦР признан еще и высокоточным анализом.

Возможность сочетания ферментных систем, определения сразу нескольких видов инфекции, а также вероятность ее обнаружения в абсолютно любой биологической жидкости делает исследование универсальным. Наиболее активно ПЦР применяется в гинекологии и урологии, поскольку здесь распространены заболевания вирусной и бактериальной природы, среди которых, сложно диагностируемые и развивающиеся скрыто.

Мазок ПЦР изо рта инфекции

Многие возбудители способны поражать ротовую полость, глотку, миндалины.

Это может быть:

  • гонококк
  • хламидия
  • бледная спирохета (сифилис)
  • герпес

Для их выявления берут мазок изо рта.

Клинический материал получают из того места, где обнаруживаются признаки воспаления.

Исследование таких мазков при помощи ПЦР имеет небольшое диагностическое значение, если имеет место поражение урогенитального тракта.

Потому что в любом случае болезнь лечат системными антибиотиками, поэтому бактерии погибают везде.

Но около 5% форм инфекций протекает в изолированной орофарингеальной форме.

То есть, бактерии во рту есть, а в урогенитальном тракте их нет.

Это почти все случаи первичного сифилиса, если заражение произошло при оральном сексе.

Нередко встречаются изолированные гонококковые или хламидийные фарингиты, тонзиллиты, стоматиты.

Их появление чаще всего обусловлено использованием презерватива во время вагинального секса.

Но при оральном контакте контрацепция не используется, поэтому происходит передача инфекции.

Анализ методом ПЦР

ПЦР анализ — что это такое? Это метод использует принципы молекулярной биологии. Для исследования материала применяются особые ферменты, которые многократно и быстро копируют ДНК, РНК фрагменты возбудителей болезни. Существует разные виды ПЦР анализа в зависимости от исследуемого материала (кровь, моча, кал и т.д.). После обработки сотрудники лаборатории сравнивают с базой данных полученный результат, выявляют концентрацию, тип возбудителя.

Анализ на ПЦР помещают в специальный амплификатор (прибор), который нагревает и охлаждает пробирки с биоматериалом. Изменения температуры нужны для репликации фрагментов. Точность результата будет зависеть от точности температурного режима. Метод полимеразной цепной реакции помогает выявить:

  • инфекционный мононуклеоз;
  • ВИЧ;
  • цитомегаловирусную инфекцию;
  • вирусные гепатиты G, C, B, A;
  • инфекции/заболевания, передающиеся половым путем (ИППП/ЗППП): гарднереллез, трихомониаз, уреаплазмоз;
  • герпетическую инфекцию;
  • онкогенные вирусы;
  • листериоз;
  • хеликобактерную инфекцию;
  • клещевой энцефалит, боррелиоз;
  • туберкулез;
  • кандидоз.

Крови

На данный момент из-за новизны технологии анализ крови методом ПЦР все еще имеет высокую цену. Для подготовки биоматериала не нужно соблюдать определенные требования. Даже вызванные физическими нагрузками, стрессами, сменой рациона питания изменения состава не влияют на результат исследования. ПЦР анализ крови может испортить только прием антибактериальных средств, поэтому перед сдачей необходимо выдержать паузу между лечением и тестом.

ПЦР исследование крови – самый распространенный вариант диагностики хронических, острых инфекционных патологий при вирусном или атипичном проявлении. Серологические методы исследования имеют определенную трудность при проведении – определение наличия возбудителя проводится по наличию антител в организме человека. Результат мог быть ложноотрицательным, если состояние больного не давало время для их выработки.

Мазка

В сфере гинекологии для исследования наличия инфекционных микроорганизмов используют ПЦР анализ мазка. Работа с материалом проводится по тому же принципу, что и с кровью: многократное увеличение фрагментов ДНК возбудителя, чтобы с легкостью его идентифицировать. Это же помогает обнаружить скрытые инфекции у женщины. Для проведения анализа могут быть взяты разные биологические жидкости: слюна, мокрота, моча, кровь. В гинекологии для точности определения чаще используется мазок со слизистой влагалища из цервикального канала.

Для проведения ПЦР существуют определенные показания. Нередко его нужно сделать, чтобы выявить устойчивый к антибиотикам вид возбудителя. У женщин основными показаниями для диагностики по этому методу выступают:

  • беременность, которая протекает тяжело;
  • острая фаза ИППП;
  • если есть подозрение на переход ИППП в хроническую стадию;
  • поиск причин бесплодия.

Кала­

Для выявления инфекции может быть назначен со стороны врача анализ кала на ПЦР. Для того, чтобы получить максимально достоверные результаты после теста, необходимо придерживаться следующих правил перед забором биоматериала:

  • за несколько суток прекратить прием слабительных препаратов: масла, свечи;
  • исключить медикаменты, которые дают специфическую окраску калу, к примеру, с содержанием железа.

Для забора следует использовать стерильную палочку и контейнер. Чем-либо их дополнительно протирать, ополаскивать не нужно. При сборе материала будьте осторожны, вы не должны задеть рукой внутренние стенки контейнера. Следите, чтобы в кале не было примесей мочи, нельзя использовать дополнительные вспомогательные средства для испражнения (клизма). Собирать материал нужно в день сдачи, хватит 1/3 объема контейнера. Данный метод диагностики имеет следующие преимущества:

  1. Анализ способен указывать на ДНК паразита, другие же тесты могут определять только остатки их жизнедеятельности.
  2. Высокая точность, будет установлен возбудитель.
  3. Ультрачувствительный анализ, который способен выявить даже одну клетку вируса.
  4. Результат исследования ПЦР будет готов через 4-5 часов.

Мочи

При необходимости для проведения теста врач может взять для исследования мочу. Высокая точность открывает возможность работать с любой биологической жидкостью, из которой удается извлечь ДНК вируса. Чтобы сдать анализ мочи ПЦР, нужно придерживаться таких ограничений перед забором материала:

  • минимум за 1 день до процедуры прекратить половые контакты;
  • за 3 недели до сдачи должно быть окончено любое антибактериальное лечение, потому что медикаменты смажут картину;
  • сдавать анализ нужно натощак (жидкость тоже запрещена);
  • брать нужно первую утреннюю порцию материала.

Как происходит сдача анализов на ПЦР

В зависимости от материала, который забирается для проведения анализа ПЦР, существует несколько обязательных правил для пациента. Кровь сдается строго натощак утром. Мочу тоже стоит сдавать утром, первую порцию. Мокрота также сдается натощак, хотя это и необязательно. Мазки сдаются в любое время суток и имеют специфические требования. Мазок из ротоглотки также следует сдавать утром до приема пищи.

Забор материала производится сертифицированным специалистом стерильными одноразовыми инструментами. Берут анализ крови на ПЦР одноразовым стерильным шприцом, из вены забирают приблизительно 1-2 мл венозной крови для выявления таких инфекций как герпес или ВПЧ (вирус папилломы человека). Мочи достаточно 10 мл, мокроты – субстанции, размером со спичечную головку.

Для каждого вида анализа ПЦР существуют свои требования:

  • кровь, как говорилось выше, забирают из вены натощак;
  • мочу следует сдавать утром, первую порцию. Но, если забор является срочным, то достаточно сдать мочу по прошествии 2 часов после последнего мочеиспускания. Это позволит инфекции набрать необходимую критическую массу на 1 мл для более простого обнаружения патогена;
  • как берут соскоб из уретры. Первым делом обрабатывают раствором NaCl 0.9% наружное отверстие уретры. Затем, совершая циркулярные движения, зонд проводят на 2-4 см в уретру. Головку зонда, которая имеет щетинистое строение отсекают и кладут в пробирку со специальным раствором (своеобразный питательный агар для бактерий);
  • из влагалища производят мазок. Предварительно убирают секрет бартолиновых желез, затем из заднего нижнего свода влагалища специальной ватной палочкой происходит забор материала. При видимых патологических изменениях во влагалище мазок следует брать непосредственно на поврежденном участке;
  • как проводят соскоб из цервикального канала у женщин. Удалив слизь из наружных половых путей, зонд на 0,5 – 1,5 см вводят в шейку матки, совершают циркулярное движение и, не касаясь стенок влагалища, удаляют зонд из половых путей. Затем совершают действия, аналогичные соскобу из уретры;
  • из ротоглотки забор происходит натощак. Придерживая кончик языка, зондом производят мазок с задней стенки глотки, по миндалинам или по небным дужкам. Не соприкасаясь со слизистой ротовой полости и зубами, зонд выводится и отправляется на пцр-исследование;
  • из конъюнктивы, предварительно очистив физиологическим раствором гнойные выделения, производят соскоб слизистой нижнего века от латерального к медиальному краю. Веко при этом придерживается медицинским работником во избежание соприкосновения зонда со слизистой глаза и ресницами.

ПЦР на коронавирус у новорожденных

Новорожденные – группа особого риска. Иммунной защиты у них практически нет, поэтому, если они инфицируются коронавирусом, то теоретически должны болеть тяжело. К счастью, сегодня случаев заражения коронавирусом у младенцев мало, практически более 80% протекает бессимптомно или в легкой форме.

Вероятно, это особенность COVID-19 и отсутствие белка-провокатора АСЕ2 на мембранах клеток у детей. В условиях пандемии ПЦР-тестирование осуществляется у младенцев на общих основаниях. Достаточно только мазка из носоглотки. Он обязателен для всех, контактировавших с заболевшими, и при наличии внезапной температуры выше 38,5°С.

Людмила Жаворонкова

Что определяет анализ

Примером активного применения ПЦР выступает тест на отцовство. Другие сферы медицины его чаще используют при симптомах инфекционных патологий, повышенном риске их хронизации, высокой вероятности заражения больного опасными для жизни вирусами (гепатит, ВИЧ).

Гинекологи, андрологи и урологи назначают ПЦР на ИППП (Инфекции, Передающиеся Половым Путем), для выявления скрытых заболеваний. Кроме того, с его помощью можно найти признаки онкологического процесса, определенные иммуноглобулины. Все сильнее набирает популярность анализ ПЦР на туберкулез, применяется для обнаружения хеликобактер пилори, как основного провокатора гастрита и язвенной болезни желудка (на ПЦР отправляют кал или желудочное содержимое).

Частные лаборатории предоставляют возможность сделать комплексный скрининг. Можно пройти обследование сразу на 6, 12 инфекций.

Таблица — О каких возбудителях информируют комплексные анализы

Инфекция ПЦР6 ПЦР12
Микоплазма гениталиум + +
Микоплазма гоминис + +
Трихомонады + +
Хламидии + +
Уреаплазмы + +
Кандиды +
Гарднереллы + +
Гонококк +
Ig M +
Ig G +
Герпес 1 +
Герпес 2 +

С помощью метода выявляют некоторых паразитов (проводят ПЦР на лямблии, описторхов, аскарид), если анализ кала показывает отрицательный результат, несмотря на наличие симптоматики. С его помощью обнаруживают возбудителя гепатитов А, B, C, D, сифилис, Эпштейна-Барра, цитомегало-, папилломавирус.

Как сдавать и через сколько готов результат

Как сдавать и через сколько готов результат

Большинство посетителей клиники испытывает лёгкий страх перед тем, как сдавать анализы. Процедура является полностью безопасной и безболезненной, количество осложнений при её проведении стремится к нулю.

Забор для лабораторной диагностики проводится по предварительной записи, ведь к визиту врача необходимо подготовиться. Легче всего подготовиться к анализу крови, никаких ограничений здесь нет.

Сдача крови осуществляется натощак, забор материала происходит из вены в объеме до 10 мл. Мазок методом ПЦР делают со слизистых шейки матки (из цервикального канала), уретры и влагалища.

Каждое предметное стекло маркируется в зависимости от отдела, откуда брали материал, латинскими буквами C, V, U и направляется в лабораторию. Сколько будет готовиться результат во многом зависит от лаборатории и её загруженности. В среднем, срок составляет двое суток. В экстренных случаях время выполнения может сократиться до нескольких часов.

ДНК полимеразы

Первые ПЦР эксперименты проводили с неустойчивым к тепловому воздействию фрагментом ДНК полимеразы І Eschericia coli Кленова, которую нужно было восполнять перед каждым циклом. Использование термостабильной ДНК полимеразы из Thermus aquaticus (Taq) сильно облегчило ПЦР и увеличило специфичность. С высокой специфичной активностью, точностью и диапазоном температуры, Taq ДНК полимераза и ее производные стали и до сих пор остаются самыми широко используемыми энзимами в ПЦР. Термостабильная ДНК полимераза является ключевым компонентом в реакции амплификации, и любой фактор, препятствующий ферментативной активности, будет влиять на функциональные возможности амплификации. ДНК полимераза может распадаться, денатурировать или может уменьшаться ее ферментативная активность вследствие действия многих веществ, присутствующих в биологических пробах.

Сейчас в продаже есть ряд ДНК полимераз из других организмов. Примерами часто используемых ДНК полимераз является rTth и Tth, выделенные из Thermus thermophilus, DyNazyme выделенная из T. brockianus,  Platinum Taq со встроенным горячим стартом, обе выделены из T. aquaticus. Эти полимеразы проявляют различные свойства относительно сопротивления к разным компонентам в биологических образцах и эффективности в присутствии этих компонентов. Выбор полимеразы влияет на эффективность нескольких ПЦР-приложений, таких как генотипирование по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и амплификация фрагментов ДНК случайными праймерами (RAPD), мультиплексная ПЦР, дифференциальный дисплей с обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR), и ПЦР с заготовленными липкими концами (autosticky PCR). Недавние исследования показали, что разные полимеразы имеют разную восприимчивость к ингибиторам ПЦР. Таким образом, подавление ПЦР компонентами биологических проб можно уменьшить или исключить выбором подходящей термостабильной ДНК полимеразы без необходимости длительной обработки образцов перед ПЦР. Выбор ДНК полимеразы определяется некоторыми факторами, относящимися к применению. Уровень сопротивления ДНК полимеразы к ингибиторам ПЦР может определяться внутренними факторами, такими как техника очистки энзима и состав реакционного буфера, а также его производство из естественного или рекомбинантного штамма. Кроме того, методика подготовки образца и наличие следовых количеств реагентов экстракции в очищенном образце может повлиять на эффективность экстракции и чувствительность ПЦР. Taq ДНК полимераза из разных коммерческих источников в разной степени ингибируется гуминовыми веществами в экстрактах почвы. Источник Taq ДНК полимеразы на этапе ПЦР также влияет на характер полос в результате дифференциального дисплея. Различная эффективность ДНК полимераз при ПЦР с ко-амплификацией также обусловлена действием солей. Полимераза Tth сохраняет как ДНК- так и РНК-зависимую активность ДНК полимеразы в присутствии 5% (v/v) фенола, в то время как следовое количество фенола ингибирует Taq ДНК полимеразу. Несколько исследований оценили эффективность и свойства разных ДНК полимераз в отношении разных ПЦР образцов, включая клинические пробы, кровь, фекалии и клеточный материал.

Таблица 2. Сравнение эффективности различных методов пред-ПЦР подготовки

Категория методов подготовки образцов Продукт подготовки образцов Однородность продукта Концентрация продукта ВыведениеПЦР ингибиторов Необходимоевремя Затраты
Экстракция ДН ДНК Высокая Средняя Да 3-6 ч Высокие
Иммуномагнитный захват Клетки/ДНК Средняя Средняя Среднее 2-4 ч Высокие
Зональное центрифугирование Клетки Средняя Высокая Среднее 30 мин Средние
Обогащение Клетки Низкая Высокая Нозкое 6-24 ч Низкие

Физиологические методы

Эти методы основаны на росте бактерий и биосинтезе клеточных компонентов, то есть составляющие генома, цитоплазмы, и клеточной поверхности. Наращивание культуры можно проводить на бульоне для накопления бактерий или агаризированной среде в чашках Петри. Опять же, целью методов является обеспечение жизнеспособных клеток-мишеней в обнаруживаемой концентрации перед проведением ПЦР. Может быть использована селективная или неселективная агаризированная или обогащенная среда, а специфичность будет частично зависеть от характеристик среды. Качество матрицы, а также однородность пробы для ПЦР, может отличаться в плане наличия клеточных компонентов. К преимуществам этой методологии относятся его простота и низкая стоимость. Метод дает возможность получить живые клетки для использования в ПЦР без дальнейшего этапа лизиса. Однако следует помнить, что клетки содержат высокие концентрации макромолекул, что может оказывать влияние и смещать равновесие во многих биохимических реакциях, например ДНК полимеразы и ее свойства связывания ДНК матрицы с праймером. Таким образом, ДНК полимераза играет ключевую роль во время амплификации ДНК с точки зрения синтеза ДНК и противодействию ингибиторам ПЦР.

Сдача мазка

При первичном осмотре женщины в консультации или платной клинике существуют несколько распространенных методов лабораторного исследования полученного материала. Обычно на приеме или при профосмотре врачи рекомендуют для сдачи три вида мазков на половые инфекции:

  1. бактериологический посев,
  2. ПЦР анализ на «скрытые инфекции» и
  3. микроскопия (т.н. «мазок на флору»).

Кроме этих есть такие методики, как флороценоз, НАСБА, цитоскрининг. В данном материале мы рассмотрим последний метод лабораторной диагностики, т.е. простой «мазок на инфекции», который чаще всего сдают на приеме и осмотре у гинеколога для начальной диагностики.
 

Сдать мазок на инфекции женщины и девушки могут из следующих мест:

Локализация М Ж Д
«C» — шейка матки   +  
«V» — влагалище   + +
«U» — уретра + + +
«R» — анус + + +
«O» — ротоглотка   + +

Подготовка к сдаче

1-2 суток перед визитом к врачу следует воздержаться от половых контактов;
Перед сдачей мазка на половые инфекции рекомендуется не мочиться в течение 2 часов.
Накануне анализа рекомендуется провести провокацию. Надежным методом считается алиментарная провокация (алкоголь + соленое, острое).
Если есть такая возможность, девушкам желательно сдавать мазок на ИППП перед или после месячных.
 

Как берут мазок на инфекцию

Взятие мазка на инфекции у женщин проводится гинекологом в смотровом кабинете на гинекологическом кресле. Во влагалище врач вводит специальный медицинский инструмент, т.н.»зеркало» и осуществляет взятие материала (выделений) из всех предполагаемых очагов с помощью одноразового шпателя — зондика. Он представляет собой пластмассовую палочку с расширенным концом, которым, делая мазки, гинеколог равномерно распределяет взятый материал по специальному чистому предметному стеклу.

На какие инфекции сдают мазок

Покажет ли мазок инфекцию? Хороший результат женского мазка (т.е. их не обнаружение) нельзя считать абсолютно достоверным, особенно при наличии определенных жалоб. Объясняется это рядом объективных моментов, влияющих на его результат. В ситуациях, когда признаки воспаления налицо, но причина его по результатам обычных мазков на инфекции не ясна, гинекологи могут прибегнуть к дополнительным методам — ПЦР-диагностике, бакпосеву.

Почему результатов мазка на инфекции бывает недостаточно для точной диагностики ЗППП:

Вирусные, хламидийные, микоплазменные и уреаплазменные инфекции практически не определяются в урогенитальном мазке на инфекции. Вирусы, хламидии, уреаплазмы и микоплазмы представляют собой микроорганизмы очень малых размеров, которые сложно заметить под микроскопом при обычном анализе мазка. Для диагностики инфекций в этих случаях существуют другие, более информативные методы (мазок ПЦР, ИФА-диагностика).

Обнаруженный грибок в мазке на инфекции — верный симптом молочницы. Но кандидоз может быть сопутствующим заболеванием, развившемся на фоне более серьезной половой инфекции (ИППП).

Повышенные лейкоциты при микроскопии мазка на инфекции могут быть следствием ошибочной диагностики, при случайном попадании в мазок при взятии гноя. Лейкоцитоз помешает врачу-лаборанту «увидеть» возбудителя.

Во многих случаях влагалищный мазок на инфекции позволяет выявить инфекцию, но не «природу» (возбудителя) этой инфекции и, что не менее важно, с помощью мазка не возможно выяснить чувствительность этих возбудителей к определенным антибиотикам. Эту проблему можно решить проведением бактериологического посева.
 

Цены на услуги

Базовые лабораторные исследования женских выделений, ₽

Методы Цены
Мазок  женский 450
Мазок мужской 500
Мазок по Граму 1 750
Бакпосев 1 750
ПЦР тесты 450
Флороценоз 3 500
НАСБА 1 300
Взятие анализа 450

Сдача мазка на инфекции

Взятие материала у женщин для анализа мазка на инфекцию гинекологи проводят ежедневно. Используются только одноразовые инструменты и расходные материалы. У девочек и девушек-девственниц зеркало при этой процедуре не применяется! Приглашаем к специалистам нашей клиники в Москве! Также возможная сдача анализов мужчинам (мазок, ПЦР, посев и анализы крови).

Время имеет значение

Также не стоит забывать и о времени, которое в вопросе определения наличия вируса в организме играет решающую роль. «Очень многое зависит от того, на каком сроке болезни находится пациент. Если это день, когда вирус размножается, то человек должен получить положительный тест. Но если точно такой же тест пациент делает на 15–20-й день после первых симптомов, то у человека может быть и отрицательный результат. Хотя пациент болен, налицо уже все последствия, пневмония, но самого вируса уже нет. Та же пневмония, которая может активно развиваться, уже не зависит от наличия вируса в организме», — говорит «Вестям» Гриневич.

По его словам, на более поздних сроках болезни, например с пятого по одиннадцатый день, Covid можно будет обнаружить с помощью компьютерной томографии. То же самое касается и экспресс-тестов.

«По ИФА-диагностике особенность следующая: антитела начинают образовываться только с седьмого дня. И в дальнейшем их становится все больше. Сначала появляются антитела М, потом — где-то с третей недели — появляются антитела G. И если человек переболел, то у него есть антитела G. Но в последнее время появляется множество информации о том, что человек переболел, а антител у него нет. Человек может заболеть повторно, и, как правило, повторные заболевания гораздо более тяжелые, чем легкое первичное», — говорит «Вестям» Гриневич.

Комментарии для сайта Cackle